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内蒙古农业大学兽医学院骆驼纳米抗体研究组—包福祥老师科研小组

添加时间:2018-05-31 11:52:23  浏览次数:[]

内蒙古农业大学兽医学院骆驼纳米抗体研究组

包福祥老师科研小组

1 包福祥老师科研小组简介

内蒙古农业大学兽医学院包福祥老师科研小组一直致力于新型基因工程抗体研究,主要的研究方向以噬菌体展示技术为基础建立骆驼纳米抗体筛选和制备平台以及蛋白突变体库的构建和筛选平台,进行肿瘤靶点和免疫检查点分子特异性纳米抗体的筛选和制备,嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)抗原识别VHH研发 ,老年痴呆症致病机理及免疫影像学配体研究等。经过十多年的经验总结和技术改进,科研小组目前建立了稳定高效的噬菌体纳米抗体库构建、筛选和表达纯化平台,具备了短时间内大量制备和鉴定特定靶标高亲和力、高特异性纳米抗体的能力。

包福祥老师简介:http://shouyi.imau.edu.cn/info/1024/7722.htm

包福祥老师联系方式:

电话:15124723150,邮箱baofuxiang@imau.edu.cn

2 纳米抗体特点

骆驼体内存在天然的缺失轻链的重链抗体,克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibodyVHH又称重链抗体(Heavy-chain antibodyHCAb)或纳米抗体(Nanobody)。VHH具有与普通抗体非常相似的抗体结合活性和亲和力;VHH容易接近靶标表面的沟、裂缝或被隐藏的抗原表位,识别许多传统抗体无法识别的抗原,同时使其具有强而快的组织穿透能力,能够穿透血-脑屏障等天然屏障和一些普通抗体难以到达的实体组织中; VHH的水溶性很好,无聚合性,而且VHH分子结构比较稳定,能够耐高温并在极端苛刻的酸碱环境中仍然保持活性;另外,VHH由单一的基因编码,易于对其进行基因工程改造,能在大肠杆菌和酵母等微生物中大量的表达;由于VHH的诸多优异的特性也使其成为肿瘤和其他疾病特异性靶向治疗药物研发的候选物质,在疾病的诊断及治疗方面有广阔的应用前景。

纳米抗体结构示意图

3 噬菌体纳米抗体库构建流程

 



IMG_20180528_144616

4 抗体库容量

 

抗体库库容量测定结果

经过优化以后,我们制备的E.coli TG1感受态经pUC19质粒检测,转化效率能够达到1012-1014VHH片段酶切后与pCANTAB5E载体连接,连接产物经过35次电转化,取100 mL菌液倍比稀释检测抗体库容量,得到抗体库的库容为3.5´109

5 抗体库转化效率鉴定图片1

抗体库转化效率测定结果

从构建的抗体库中随机挑取23个克隆进行菌落PCR,有22个克隆为阳性,阳性率达到95.7%

6 噬菌体抗体库富集和筛选

抗体库经过M13K07辅助噬菌体挽救及三轮的“结合-洗涤-洗脱-扩增”富集和筛选,随机挑取90个克隆进行Phage ELISA鉴定,得到51个阳性克隆。

 

Phage ELISA鉴定抗原特异性纳米抗体

7纳米抗体的表达和纯化

SDS-PAGE鉴定纳米抗体表达和纯化结果

M:分子量marker1:未诱导,2:诱导,3:洗脱14:洗脱25:洗脱3

纳米抗体基因在大肠杆菌表达系统中诱导表达后,以可溶性的形式表达在细菌破碎后的上清中,经过Ni-NTA介质亲和纯化,能够得到高浓度和纯度的纳米抗体。

8纳米抗体对抗原的特异性结合

ELISA鉴定纳米抗体对抗原的结合活性

经纯化的纳米抗体,在1 mg50 pmol)情况下显示出对抗原有非常高的亲和活性。

 


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